1
革蘭氏染色
在很多微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中都會涉及到染色鏡檢這一步，其中絕大部分都是指的革蘭氏染色。
原理
革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚，類脂含量低，交聯(lián)度高，用乙醇處理后，發(fā)生脫水作用，肽聚糖層孔徑縮小，通透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，故細(xì)菌仍保留初染時的紫色。
革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，含較多類脂質(zhì)，故用乙醇處理后，類脂質(zhì)被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細(xì)胞被脫色，經(jīng)沙黃復(fù)染后呈紅色。
染色步驟
革蘭氏染色注意事項(xiàng)
1.選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁通透性發(fā)生改變?nèi)菀妆蝗境杉t色而造成假陰性。
2.涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。
3.脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。
樣品中分離芽孢桿菌的革蘭氏染色
（紫色為菌體，芽孢無法著色）
2
結(jié)晶紫染色
《GB 4789.26-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無菌檢驗(yàn)》中還涉及到一種染色方法：結(jié)晶紫單染色。
結(jié)晶紫是一種堿性染料，能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)內(nèi)核酸染色。結(jié)晶紫單染色通過結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色，使微生物細(xì)胞與背景形成鮮明的對比，易于在顯微鏡下觀察菌體的一般形態(tài)。
01
涂片
針對商業(yè)無菌檢驗(yàn)時，涂片方法為----帶湯汁的樣品，可用接種環(huán)挑取湯汁涂于載玻片上，固態(tài)食品可直接涂片或用少量滅菌生理鹽水稀釋后涂片，待干后用火焰固定。油脂食品涂片自然干燥并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。
對于一般微生物的結(jié)晶紫單染色，涂片方法可參考革蘭氏染色。
02
染色
將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。
03
鏡檢
針對商業(yè)無菌檢驗(yàn)時，應(yīng)至少觀察 5 個視野，記錄菌體的形態(tài)特征以及每個視野的菌數(shù)。與同批冷藏保存對照樣品相比， 判斷是否有明顯的微生物增殖現(xiàn)象。菌數(shù)有百倍或百倍以上的增長則判為明顯增殖。
混合微生物菌體的結(jié)晶紫單染
(大橢圓為釀酒酵母ATCC9763，桿菌為大腸桿菌ATCC25922，球菌為金黃色葡萄球菌ATCC6538)
3
芽孢染色
芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行著色使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)分。
試劑
5%孔雀石綠染色液----給芽孢染色，使芽孢呈綠色；
沙黃染色液----給菌體染色，使菌體呈紅色。
芽孢染色的方法大家可以查看我們之前的推文“芽孢染色方法介紹”。在這篇文章中我們詳細(xì)地介紹了傳統(tǒng)的芽孢染色操作方法，并且對其操作方法進(jìn)行了改良，使其更便于操作，大家不妨看一看。
芽孢染色鏡檢圖片
（紅色為菌體，藍(lán)綠色為芽孢）
4
蛋白毒素結(jié)晶染色
在《GB 4789.14-2014 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)中，我們需要做革蘭氏染色鏡檢，在此基礎(chǔ)上也可以做芽孢染色。除此之外，蛋白毒素結(jié)晶染色也是我們繞不過去的一道坎。
蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌除了用蛋白毒素結(jié)晶染色外，以生化鑒定的方式是無法將它們區(qū)分開的。所以蛋白毒素結(jié)晶染色對于蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)來說也是很關(guān)鍵的一步。
培養(yǎng)基：硫酸錳營養(yǎng)瓊脂----用于培養(yǎng)菌體，其有利于蘇云金芽孢桿菌蛋白毒素結(jié)晶的產(chǎn)生；
試劑：甲醇、0.5%堿性復(fù)紅染液
小伙伴們?nèi)绻粫龅鞍锥舅亟Y(jié)晶染色的話，那就來看看“蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)，知多少？”這篇文章吧。相信大家看完這篇文章，做起蛋白毒素結(jié)晶染色來肯定就得心應(yīng)手了。
蛋白毒素結(jié)晶染色鏡檢圖片
（紅色箭頭所指為蛋白毒素結(jié)晶，藍(lán)色所指為芽孢）
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