芽孢是細(xì)菌的休眠體，當(dāng)細(xì)菌菌體營養(yǎng)缺乏時(shí)形成。通常為圓形或橢圓形，位于細(xì)菌菌體的一端或者中間。
由于芽孢結(jié)構(gòu)特殊，芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難。所以，普通染色方法（如革蘭氏染色）只有菌體著色，而芽孢無法著色而呈現(xiàn)無色。?
因此，如想要芽孢著色，需要使用著色力強(qiáng)的染色劑（如孔雀石綠）在加熱條件下進(jìn)行染色。染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染色的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅溶液）染色后，芽孢仍然保留初染劑的顏色，而菌體被染成復(fù)染劑的顏色，即菌體和芽孢分別染成紅色和綠色易于區(qū)分。
下面以嗜熱脂肪芽孢桿菌為例介紹孔雀石綠芽孢染色法的兩種操作。
準(zhǔn)備合適菌齡的平板，本次實(shí)驗(yàn)使用嗜熱脂肪芽孢桿菌在胰酪胨大豆瓊脂上的48h培養(yǎng)物。多數(shù)芽孢尚在菌體中。如果觀察大量游離芽孢?，需要培養(yǎng)至5-7天。
使用5%孔雀石綠作為初染液，番紅作為復(fù)染液。
1、首先介紹第一種操作，酒精燈直接加熱。具體操作如下：
3、用酒精燈外焰加熱至冒蒸汽狀態(tài)，維持10min-15min。注意添加染液，避免干燥。
4、玻片冷卻后，用水沖洗至沒有浮色。
縱觀整個(gè)操作過程發(fā)現(xiàn)此方法難度較大
載玻片需要持續(xù)微沸的狀態(tài)，手持載玻片時(shí)手臂容易疲勞。
載玻片持續(xù)處于高溫狀態(tài)，容易發(fā)生崩裂的情況，要選擇質(zhì)量更好的載玻片同時(shí)注意操作安全。
染液需要不斷補(bǔ)充以防干結(jié)，試劑消耗量大。
加熱過程中，試劑會(huì)有迸濺的情況，注意做好防護(hù)措施。
加熱完后載玻片染液殘留多，不易洗凈。可能影響后期鏡檢觀察。
2、由于酒精燈直接加熱操作難度比較大，且容易有安全隱患，我們介紹另外一種改良的芽孢染色操作——水浴加熱。具體操作如下：
?3、將此試管浸于沸水浴 ，加熱 15min—20min??
4、用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，涂片，晾干。固定；水洗。
改進(jìn)后的方法，不再使用直接加熱載玻片的方式，實(shí)驗(yàn)過程更安全，操作更加簡便。同時(shí)染液的用量大大減少，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
芽孢染色的方法除以上介紹的兩種操作外還有其他的方法，比如微波加熱法等。實(shí)驗(yàn)室可以酌情使用。
—— —— 染色小貼士 —— ——
●涂片時(shí)選擇適宜菌量，避免聚團(tuán)。涂片面積不宜過大，可采用以上操作中使用的帶有限位圈的玻片。●細(xì)菌的鏡檢觀察，使用百倍油鏡，注意顯微鏡維護(hù)。